مشاهده مطالب کاربر

تعداد مطالب : 149

تعداد نظرات : 21

زمان آخرین مطلب : 4343روز قبل

دنیای گیاهان و حیوانات

سیب Apple (Malus spp. Mill) :خصوصیات گیاهشناسی: - تعداد كروموزوم پایه : n=17- دارای ارقام 2n، 3n، 4n و 5n است. - نام علمی: M. x domestica كه یك هیبرید بین ‌گونه‌ای است. در كتاب میوه‌كاری در مناطق معتدله وست وود نام آن M. pomilla ذكر شده است.- منشأ: از غرب آسیا و جنوب سیبری - خزان‌پذیر، به ندرت به صورت درختان یا درختچه‌های همیشه سبز و به ندرت دارای شاخه‌های خاردار. - برگها اره‌ای یا كنگره‌ای در حاشیه و دارای گوشوارك (Stipule) - گلها سفید، صورتی یا قرمز و هرمافرودیت- گلها همزمان با برگها باز می‌شوند جوانه‌های آن mixed هستند.- گل‌آذین‌: گرزن (cyme) دارای شاه‌گل (king flower) - هر گل‌آذین دارای 6-5 گل كه در كنار آن 6-5 برگ نیز از جوانه خارج شده است.- تخمدان : تحتانی، مادگی دارای 5 خامه تعداد برچه پرچم كاسبرگ گلبرگ - فرمول گل : P(5) + S(5) + A(20) + G(5)برچه 2 تخمك max 10 بذر- محل تشكیل گلها: در نوك شاخه‌ها یا بر روی اسپورهای دو یا چند ساله. در برخی ارقام استثنائاً‌ روی جوانه‌های جانبی شاخه‌های یكساله.- گرده افشانی: اكثر ارقام دگرگشن، تعداد كمی تا حدودی خودگشن. در همین ارقامی كه تا حدودی خودگشن هستند نیز دگرگشنی سبب افزایش محصول می‌شود. گرده افشانی با حشرات بخصوص زنبور عسل صورت می‌گیرد.- زمان گلدهی: معمولاً 2-1 هفته پس از اكثر هسته‌دارها. در كرج = اوایل اردیبهشت - زمان گل‌انگیزی: 40 روز پس از تمام گل (اواخر خرداد و اوایل تیر)- زمان رسیدن:180 – 70 روز پس از تمام گل در ارقام مختلف متفاوت است. زودرس، متوسط رس، دیررس داریم ولی عمدتاً پس از هسته‌دارها و قبل از انگور و كیوی است.- بهترین شاخص رسیدن میوه: تعداد روز پس از تمام گل - تناوب باردهی: در اكثر ارقام سیب وجود دارد. چون زمان گل آغازی آ‌نها هم زمان بازمانی است كه میوه‌ها‌اندازه فندق‌هستند و بذرهایشان‌هورمون بازدارنده ‌تولید‌می‌كنند و مانع‌گل انگیزی سال بعد می‌شوند.

شنبه 21/5/1391 - 22:9

[ نظر به این مطلب ] - [ نظرات این مطلب : 0 ]

دنیای گیاهان و حیوانات

مشخصات درختان میوه دانه دار

شنبه 21/5/1391 - 17:50

[ نظر به این مطلب ] - [ نظرات این مطلب : 0 ]

دنیای گیاهان و حیوانات

مشخصات درختان میوه دانه دار

الف) میوه‌های دانه‌دار (Pome Fruits)- از خانواده Rosaceae و زیر خانواده Pomoidae هستند.- تعداد كروموزوم پایه آنها n=17 است.- مهمترین دانه‌دارهای خوراكی: سیب یا Apple (Malus spp.)، گلابی یا Pear(Pyrus spp.) و به یا Quince (Cydonia spp.).- سایر دانه‌دارها كه بیشتر به عنوان پایه بكار می‌روند: به ژاپنی (Chaenomeles sp.)، Medlar (Mespilus germaniaca)، Howtorn (Cratagus sp.)، زبان گنجشك‌كوهی rowan یا Mountain ash (Sorbus spp.) وService berry (Amelanchier spp.). دو گیاه‌ اخیر دارای‌ میوه‌های‌ سته‌مانند هستند. - تعداد كروموزوم پایه (n=17)‌ این خانواده در اثر یك Allopolyploidای حاصل شده است. یعنی در اثر دو برابر شدن خودبخود تعداد كروموزومها در یك هیبرید بین‌گونه‌ای عقیم كه حاصل تلاقی گامت
8n= * 9=n 17= n 34= 2xاست بوجود آمده است. O O+زیرخانواده Pronoidae * Sproidae زیرخانواده (n=8) (n=9) Pome Fruits (n=17)- در برخی گونه‌های دانه‌دارها ارقام پلی پلوئید هم داریم كه این ارقام عمدتاً از آپومیكسی حاصل شده‌اند. - در دانه‌دارها قسمت گوشتی میوه Pome است كه شامل كاسه گل و نهنج است و به تخمدان مربوط نیست. گاهی ممكن است میوه بدون لقاح تشكیل شود.

شنبه 21/5/1391 - 17:49

[ نظر به این مطلب ] - [ نظرات این مطلب : 0 ]

دانستنی های علمی

توالی یابی

بر اساس اصول فوق دو روش برای تعیین توالی DNA ابداع گردید:1) روش خاتمه زنجیره (Chain Termination squencing)2) روش تجزیه شیمیایی (Chemical Degradation squencing)اشكال عمده در تعیین توالی DNA دو رشته‌ای در مقایسه با DNAهای تك رشته‌ای در این است كه حضور رشته مكمل در آزمایشات منجر به افزایش میزان خطاها در تعیین توالی می‌گردد. این خطاها به صورت مناطقی برروی ژل آشكار می‌شوند كه در یك نقطه از ژل بیش از یك باند وجود دارد در نتیجه مشكل بتوان تصمیم گرفت كه نوكلئوتید واقعی در این جایگاه كدام یك است. خطاهایی از این نوع تنها محدود به آنالیز DNA دو رشته‌ای نمی‌باشند و برخی از آنها یك مشكل عمومی در آزمایشات تعیین توالی می‌باشند. در صورت بروز این خطاها می توان برای رفع ابهام آزمایش را با یك پرایمر جدید با استفاده از رشته دیگر به عنوان الگو، تكرار كرد. در مورد توالی‌های بزرگتر از 700-600 نوكلئوتید حتی در صورت استفاده از DNA تك رشته‌ای در آنالیز توالی نیز همیشه نمی‌توان بدون بروز این خطاها محصولات واكنش‌ها را بر روی ژل الكتروفورز یا كاغذ كروماتوگرافی دقیقا از یكدیگر تفكیك نمود و البته این اندازه نوكلئوتیدی حداكثر طول توالی است كه می‌توان توسط تركیب ویژه‌ای از الیگو ـ پرایمر آنرا تشخیص داد.پیمایش با پرایمر ((Primer walking روشی دیگر برای تهیه الگو در آزمایشات تعیین توالی است. در این روش ابتدا یك پرایمر الیگونوكلئوتیدی كه مكمل بخش انتهایی ناحیه شناخته شده یك توالی DNA است طراحی می‌گردد و پس با جفت كردن این پرایمر نشاندار با بخش مكمل آن، دنباله آن كه در واقع بخش مكمل با ناحیه ناشناخته است سنتز می‌گردد و به این صورت كپی‌های تك رشته‌ای از ناحیه ناشناخته تهیه می‌شود كه می‌توان در آزمایشات تعیین توالی از آنها استفاده كرد.البته می‌توان در همین روش به جای سنتز رشته جدید، با حذف آنزیمی توالی‌های موجود در فرودست ناحیه اتصال پرایمر به الگو مجموعه‌ای از قطعات ناشناخته تهیه كرد.یكی از روش هایی كه در تاریخ علم تعیین توالی ژنوم كامل موجودات بسیار مهم شده است روش تعیین توالی شكاری ((Shotgun sequencing است كه در اوایل كشف تعیین توالی از آن استفاده می‌شد در این روش DNAیی كه قرار است توالی آن مشخص شود به طور تصادفی شكسته می‌شود و آنگاه قطعات حاصل در یك پلاسمید یا حامل M13 كلون می‌شوند.سپس از محل اتصال این قطعات به DNAی حامل همانند سازی در یك یا هر دو جهت آغاز می‌شود. فرایند تكثیر تا زمانی كه مقدار DNAی تولید شده به 10ـ5 برابر DNA الگوی اولیه برسد ادامه می‌یابد و بعداً با استفاده از كامپیوتر هم پوشانی توالی‌های مختلف در این مجموعه DNA خوانده می‌شود و از این اطلاعات می‌توان برای تعیین توالی مولكول DNA اولیه استفاده كرد. هرچه تعداد این هم پوشانی‌ها كه دارای نقاط شروع و پایان متفاوتی هستند و در جهتهای مختلفی نیز خوانده می‌شوند بیشتر باشد به همان میزان اطمینان از صحت توالی تعیین شده نیز بالاتر می‌رود.با تعیین توالی هر 2 رشته مولكول DNA به طور مجزا و با تائید مكمل بودن آنها می توان خطاهای تولید شده در زمان آزمایش یا در طی مرحله الكتروفورز را تشخیص داده و حذف كرد. امروزه روش های خودكار تعیین توالی تغییری اساسی در سرعت و جهت گیری پرو‍ژه‌های ژنومی ایجاد كرده است. از طریق این روش ها تا زمان نگارش كتاب توالی كامل ژنوم بسیاری از باكتریها چون مخمر Saccharomces cerevisiae و Caenorhabditis تعیین شده است و پروژه ژنوم انسانی نیز رو به كامل شدن است. تهیه الگو برای آزمایشات تعیین توالیدر روش خاتمه زنجیره برای تعیین توالی DNA می بایستی از DNA تك رشته‌ای استفاده شود تا پرایمر امكان یابد بدون هیچ ممانعتی به الگوی خود دسترسی داشته باشد. یكی از روش های تهیه DNA تك رشته‌ای تزریق فرم دو رشته‌ای آن به یك ویروس باكتریایی است كه این ویروس به طور طبیعی تنها یكی از دو رشته را به میزبان باكتریایی خود وارد می‌كند.البته با استفاده از این روش یك مرحله دیگر را به آزمایشات تعیین توالی می‌افزاید و علاوه بر وقت گیری این روش، انجام آن نیز همواره راحت و موفقیت آمیز نیست. روش دیگر واسرشت كردن DNA دو رشته‌ای توسط محلولهای قلیایی است كه در این صورت باید قبل از دوباره چسبیدن رشته‌ها به یكدیگر پرایمر را به آنها افزود با این روش تجزیه و تحلیل DNAهای دو رشته‌های نیز امكان پذیر می‌باشد و امروزه بیشتر از این روش استفاده می‌شود. توالی یابی پایان دهی زنجیره (انجام واكنش‌های سنتز رشته)تا این مرحله شما DNA الگو تك رشته‌ای را تهیه كرده‌اید و اكنون جهت انجام واكنش‌های سنتز رشته آماده هستید. این واكنش‌ها با چهار خانواده از پلی نوكلئوتیدهای پایاندهی زنجیره انجام می‌شوند و سپس در الكتروفورز ژل پلی اكریل آمید لود می‌گردند.واكنش‌های سنتز رشته آسانترین بخش از روش توالی یابی DNA می‌باشند. اگرچه تعدادی از معرف های ((Reagents مختلف باید با همدیگر مخلوط شوند، ولی این مرحله نسبت به مرحله هضم برشی پیچیده‌تر نمی‌باشد. بطور كلی در همه روش های بیولوژی مولكولی، اگر از معرف های با كیفیت خوب استفاده گردد و پیپت نمودن ((Pipetting به دقت انجام شود، تقریباً آزمایش همیشه موفقیت آمیز خواهد شد. واكنش‌های توالی‌یابی DNA با در دسترس بودن كیت‌های تجارتی توالی یابی، آسانتر انجام می‌شوند. این كیت‌ها محتوی معرفهای پیش مخلوط ((Premixed بوده و دستورالعمل‌های دقیقی در خصوص چگونگی استفاده از آنها را نیز دارا می‌باشند و به مهارت‌های خاصی نیز نیاز ندارند، چون در بیشتر كیت‌ها، معرف ها دارای كدهای رنگی می‌باشند؛ اما كیت‌های مورد استفاده باید قابل اطمینان باشند. در حقیقت در استفاده از مخلوط معرف های مربوط به كیت‌ها جهت توالی‌یابی، درك چگونگی عمل آنها نیز مهم می‌باشد. اگر شما نفهمید لوله آبی چه كاری انجام می‌دهد یا این كه حمام آبی 37 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه باعت چه عملی می‌شود، نمی‌توانید اشتباهات احتمالی را رفع كنید و تحقیق به بن بست می‌رسد. در پست های بعدی، هریك از معرف هایی كه در واكنش‌های سنتز رشته استفاده می‌شوند؛ بررسی می‌گردند. -2در این نوشتار هریك از معرف هایی كه در واکنش های سنتز رشته استفاده می‌شوند بررسی می‌گردند.1ـ اجزای تشكیل دهنده واکنش های سنتز رشتهنخست باید وقایعی كه در مدت واکنش های سنتز رشته روی می‌دهد را بررسی كنیم. نخستین مرحله اتصال یا چسباندن یك پرایمر الیگونوكلئوتیدی كوتاه به هر یك از مولکول های الگوتك رشته‌ای می‌باشد. پرایمر به عنوان نقطه شروع یك زنجیره پلی نوكلئوتیدی جدید كه مكمل رشته الگو است؛ عمل می‌كند. سنتز رشته توسط آنزیم DNA پلی مراز انجام می‌شود و به دی اكسی نوكلئوتید تری فسفات‌ها به عنوان سوبسترا نیاز دارد. معمولاً یك یا چند تا از این dNTP_S ((Deoxynucleotide triphosphates با یك نشانگر رادیواكتیو(Redioactive marke) برچسب دار می‌شوند تا بعداً الكتروفورز ژل و اتورادیوگرافی قابل رؤیت باشند. هنگامی كه نوكلئوتید پایاندهی زنجیره در مخلوط واكنش قرار گیرد؛ سنتز رشته متوقف می‌شود و بدین ترتیب امكان ایجاد چهار خانواده از مولکول های پایان دهی زنجیر وجود خواهد داشت. به طوری كه یك خانواده شامل پلی نوكلئوتیدهایی است كه به A ختم می‌شوند؛ خانواده دوم به C ختم می‌گردند و الی آخر. چهار خانواده سپس توسط الكتروفورز ژل پلی اكریل آمید تفكیك می‌شوند تا الگوهای باندی Banding pattern) به دست آید كه از روی آنها، توالی خوانده می‌گردد.1ـ1ـ پرایمرDNA پلی مراز وابسته به الگو قادر به شروع سنتز DNA در یك مولكول DNA تك رشته‌ای، بدون وجود پرایمر نخواهد بود. در حقیقت یك ناحیه دو رشته‌ای كوتاه مورد نیاز است تا انتهای 3 را فراهم نموده تا پلی مراز بتواند نوكلئوتیدهای جدید را اضافه كند. این انتهای 3 را پرایمر فراهم می‌كند و بدون آن سنتز رشته انجام نمی‌شود. ممكن است چنین تصور كنید كه استفاده از پرایمر در آزمایش توالی یابی DNA دردسر ساز است؛ چون نیاز به یك مرحله اضافی در توالی یابی دارد. در واقع پرایمر یك نقش حساسی را در روش پایان دهی زنجیره بازی می‌كند؛ زیرا پرایمر نقطه شروع واکنش های سنتز رشته را تعیین می‌كند.استفاده از پرایمر موارد ذیل را تأمین می‌كند:الف) همه رشته‌های سنتز شده به وسیله DNA پلی مراز یك انتها خواهند داشت. از آن جایی که طول های زنجیره‌های پایان یافته، توالی رشته الگو را منعكس می‌نمایند؛ وجود یك انتها برای همه رشته‌ها ضروری است.ب) تنها بخش مورد نظر از مولكول الگو توالی یابی می‌گردد.مورد دوم بسیار مهم است؛ زیرا در یك آزمایش توالی‌یابی بیش از چند صد جفت باز را نمی‌توان به دست آورد. در حالی که مولكول الگو (ناقل به همراه DNA وارد شده) چندین كیلو باز طول دارد. بنابراین باید هر آزمایش توالی‌یابی در ناحیه خاصی از الگو كه مد نظر است هدایت گردد. در عمل، همیشه از پرایمری استفاده می‌شود كه در مجاورت یكی از اتصال ها، بین ناقل و DNA وارد شده، به مولكول الگو می‌چسبد. این مكان ایده آلی برای شروع سنتز رشته می‌باشد؛ زیرا كه DNA پلی مراز فوراً شروع به خواندن DNA وارد شده می‌كند. بنابراین قطعه DNA همسانه شده توالی‌یابی می‌گردد. جایگاه اتصال پرایمر در درون ناحیه Lacz مولكول ناقل نشان داده شده است. از آن جایی که این ناحیه دارای توالی یكسانی در همه ناقل‌های حاوی ‍ژن Lacz می‌باشد (همه ناقل‌های M₁₃ و ناقل‌های فاژمید)، بنابراین سنتز پرایمرهای مختلف برای هر آزمایش توالی‌یابی ضروری نیست. در حقیقت یك پرایمر جهانی (پرایمری كه توالی آن مكمل قطعه مربوط به ژن Lacz است) برای همه آزمایشات صرف نظر از منشاء DNA همسانه شده مناسب خواهد بود.از نظر تئوری، سنتز رشته می‌تواند با پرایمرهای كاملاً كوتاه با اندازه‌ای در حدود 2 نوكلئوتید شروع شود. در عین حال باید مطمئن شویم كه پرایمر به مكان هدف بچسبد و چسبیدن آن با شانس و تصادف نباشد. همچنین به مكان ثانویه در الگو متصل نگردد. اگر این حالت اتفاق بیفتد دو توالی به دست آمده در ژل پلی اكریل آمید روی هم تأثیر گذاشته و هیچ كدام قابل خواندن نخواهند بود. بیشترین پرایمرهای جهانی كه به طور تجارتی قابل دسترس هستند 24ـ15 نوكلئوتید دارند. این اندازه شانس اتصال دوگانه (Universal primer) پرایمر را به حداقل می‌رساند. الیگونوكلئوتیدی كه 15 نوكلئوتید طول دارد 15mer و اگر 20 نوكلئوتید طول داشته باشد 20mer گفته می‌شود.آیا نیاز است كه شما از یك پرایمر به غیر از پرایمر جهانی استفاده كنید؟ در برخی موارد پرایمری كه به درون DNA وارد شده می‌چسبد، نسبت به پرایمری كه به یك طرف آن می‌چسبد ترجیح داده شود؛ به طوری که استفاده از این پرایمر شما را قادر می‌سازد تا توالی ناحیه‌ای از DNA وارد شده را به دست آورید كه از نقطه اتصال ناقل ـ DNA وارد شده (Insert Vector junction ) (جهت توالی یابی با یك پرایمر جهانی) خیلی دور است. بنابراین از پرایمرهای درونی ((Internal Primers جهت به دست آوردن توالی كامل یك DNA وارد شده (كه با پرایمرهای جهانی قابل توالی‌یابی نمی‌باشد) می‌توان استفاده نمود.اگرچه این روش ممكن است یك ایده مطلوب به نظر برسد، اما استراتژی های زیر همسانه سازی، راه های بهتری برای به دست آوردن توالی‌های طولانی می‌باشند. پرایمرهای درونی چندین عیب دارند كه عمده‌ترین آن هزینه ی بالای تهیه یك الیگونوكلئوتید خاص برای هر آزمایش توالی‌یابی می‌باشد.هریك از زیر همسانه‌سازی تولید شده به وسیله ی یكی از استراتژی‌های ذكر شده می تواند با پرایمرهای جهانی توالی‌یابی شود.1ـ2ـ DNA پلی‌مرازهر آنزیمی كه DNA را سنتز كند DNA پلی مراز نامیده می‌شود. بیشتر DNA پلی مرازها وابسته به الگو (Template - dependent ) هستند. این بدان معنی است كه رشته DNA جدید از روی الگو تك رشته‌ای موجود سنتز می‌شود و توالی رشته جدید مكمل توالی الگو است. برخی از آنزیم‌ها از الگو DNA استفاده می‌كنند؛ از این رو پلی مرازهای وابسته به DNA می‌باشند. برخی دیگر از RNA استفاده می‌كنند. پلی مرازهای DNA وابسته به RNA را ترانسكریپتازهای معكوس (نسخه برداری‌های معكوس) (Reverse transcriptases) می‌نامند. تمامی DNA پلی مرازها، DNA را در جهت 5 پرین به 3 پرین سنتز می‌نمایند، یا به عبارت دیگر نوكلئوتیدها را به انتهای 3 پرین رشته در حال ساخت اضافه می‌نمایند.از آن جایی که سنتز در جهت 5 پرین به 3 پرین است، پس الگو باید در جهت 3 پرین به 5 پرین خواندن شود، زیرا كه دو رشته یك مولكول اسید نوكلئیك دو رشته‌ای همیشه در جهت مخالف هم هستند.تمامی موجودات زنده دارای DNAهای پلی مراز می‌باشند. این آنزیم‌ها نقش اساسی را در همانند سازی و تعمیر مولکول هایDNA سلول بازی می‌كنند. به علاوه بسیاری از باكتریوفاژها و ویروس‌ها دارای ژنهایی هستند كه این ژنها بعد از آلودگی، باعث سنتز DNA پلی مرازهای جدیدی می‌گردند، تا به كمك آنها فاز یا DNA ویروسی همانند سازی گردد. بنابراین تعداد زیادی DNA پلی مراز مختلف با خواص متفاوت وجود دارد. یك DNA پلی مراز زمانی برای توالی یابی DNA مناسب است كه برخی معیارها را داشته باشد. مهمترین این معیارها قدرت عمل بالا (High processivty) و فعالیت اگزوتوكلئازی پایین (Low exonuclease activity) می‌باشد. در چند صفحه بعد این معیارها و همچنین شاخص‌های كم اهمیت دیگر (به عنوان خواصی كه یك آنزیم ایده‌آل توالی‌یابی DNA باید دارا باشد) را مرور خواهیم نمود. سپس تعداد از DNA پلی مرازهایی كه در توالی یابی DNA استفاده می‌شوند را بیان و نقاط ضعف و قوت هریك را ارزیابی خواهیم كرد.1ـ2ـ1ـ قدرت عملقدرت عمل اشاره دارد به طول رشته جدیدی كه یك DNA پلی مراز قادر است سنتز نماید، قبل از اینكه واكنش از طریق عوامل طبیعی پایان یابد. هیچ DNA پلی مرازی بطور نامحدود قادر به سنتز DNA نمی‌باشد،به طوری که پایاندهی زنجیره در نقاطی كه آنزیم از الگو جدا می‌شود اتفاق می‌افتد یك آنزیم باقدرت عمل پایین برای توالی یابی DNA مناسب نمی‌باشد، زیرا ممكن است قبل از اینكه یك نوكلئوتید پایاندهی زنجیره درج شود از مولكول الگو جدا شود. بنابراین رشته‌هایی كه به طور تصادفی از این طریق پایان یافته‌اند، تولید یكسری باندهای اضافی در ژل پلی اكریل آمید می‌نمایند كه خواندن توالی را غیر ممكن و یا مشكل می‌نمایند. از اینرو آنزیم‌های توالی‌یابی باید قدرت عمل بالایی داشته باشند.1ـ2ـ2ـ فعالیت‌های اگزونوكلئازیبسیاری از DNA پلی مرازها آنزیم‌های دوكاره (Dual function) هستند، یعنی از یك طرف قادر به سنتز و از طرف دیگر قادر به حذف نوكلئوتیدها از زنجیره می‌باشند. این حالت ممكن است منحصر به فرد به نظر برسد، اما با وظایفی كه این آنزیم‌ها در سلول ایفا می‌كنند مطابقت دارد. به عنوان مثال DNA پلی مراز E.coli J یك آنزیم تعمیری DNA می‌باشد. یعنی به منظور تصحیح اشتباهاتی كه در طول همانند سازی DNA یا در اثر موتاسیون رخ داده است، مبادرت به حذف نوكلئوتیدهای یك رشته DNA می‌نماید. جهت انجام این عمل آنزیم به یك فعالیت اگزونوكلئازی 5 پرین به 3 پرین نیاز دارد. به علاوه DNA پلی مراز I، مانند بیشتر DNA پلی مرازهای دیگر دارای عمل خواندن ضعیفی است و این كمك می‌كند تا هر اشتباهی كه در طول سنتز DNA رخ داده است تصحیح گردد. آنزیم باید در جهت عكس حركت نماید تا نوكلئوتیدهای اشتباه را از رشته‌های DNA در حال سنتز حذف نماید. از این رو این آنزیم به فعالیت اگزونوكلئازی در جهت 3 پرین به 5 پرین نیاز دارد. بنابراین دو نوع فعالیت اگزونوكلئازی برای تصحیح عملكرد آنزیم DNA پلی مراز مورد نیاز است. متاسفانه هر دو نوع فعالیت اگزونوكلئازی در طول توالی یابی پایاندهی زنجیره ایجاد مزاحمت می‌كنند. عمل اگزونوكلئاز 5 پرین به 3 پرین یك مشكل اساسی‌تر می‌باشد، زیرا آنزیم‌هایی كه دارای این خاصیت هستند می‌توانند نوكلئوتیدها را از انتهای 5 پرین رشته پایاندهی زنجیره حذف نمایند. اگر این عمل اتفاق بیافتد، اندازه‌های مولکول های پایاندهی زنجیره متغیر گردیده و توالی الگو را منعكس نمی‌سازند و در نتیجه الگوی بانددهی درژل پلی اكریل آمید قابل تفسیر نخواهد بود. بنابراین برای اینكه توالی یابی پایاندهی زنجیره به خوبی انجام گیرد لازم است كه DNA پلی مراز فاقد یا دارای فعالیت ناچیز اگزوتوكلئازی 5 پرین به 3 پرین باشد.همچنین عمل اگزونوكلئاز 3 پرین به 5 پرین كمی مشكل ساز است. در حقیقت عملی كه توسط فعالیت این اگزونوكلئاز انجام می‌گیرد دردسر ساز است، به طوری که ممكن است نوكلئوتیدهای غیر عادی (تغییر شكل یافته) مانند دی اكسی اینوزین تری فسفات (Deoxyinosine triphosphate) به مخلوط واكنش اضافه شوند. این نوكلئوتیدهای تغییر شكل یافته تحت شرایط خاصی استفاده می‌شوند تا نتایج آزمایش توالی‌یابی بهبود یابد. مشكل اینجاست كه بسیاری از پلی مرازهای، با عمل خواندن ضعیف، قادر به تشخیص و حذف نوكلئوتیدهای تغییر شكل یافته خواهند بود. این عمل هدف استفاده نوكلئوتیدهای تغییر شكل یافته را در نخستین موقعیت بی‌اثر می‌سازد. خواندن ضعیف حتی قادر است با حذف نوكلئوتید پایاندهی زنجیره (به محض اضافه شدن) از پایان یافتن زنجیره جلوگیری نماید. علاوه براین یكسری مشكلات دیگر وجود دارد كه عموماً به اگزونوكلئاز 3 پرین به 5 پرین نسبت داده می‌شوند. بنابراین پلی مراز ایده‌آل جهت توالی یابی باید خاصیت اگزونوكلئازی نداشته باشد.1ـ2ـ3ـ خصوصیات دیگر پلی مراز ایده‌ال برای توالی یابی DNAعلاوه بر قدرت عمل بالا و فعالیت اگزونوكلئازی پایین، DNA پلی مراز ایده‌آل برای توالی یابی پایاندهی زنجیره باید خصوصیات زیر را نیز داشته باشد:1ـ در دمای 55 درجه سانتی گراد و بالاتر از آن فعالیت نمایدیك مشكل عمده آزمایش توالی‌یابی این است كه بخشهایی از الگو، به واسطه جفت شدن بازها بین نواحی مختلفی از مولكول تك رشته‌ای، خارج از دسترس می‌شوند. این نوع جفت شدن باعث ایجاد ساختارهای ثانویه (Secondary structures ) از قبیل حلقه‌های سنجاق سری (Hairpin loop) می‌گردد كه DNA پلی مراز نمی‌تواند در آن نفوذ نماید، بنابراین از سنتز رشته ممانعت می‌شود. اگر DNA وارد شده غنی از GC باشد این مشكل حادتر می‌گردد، زیرا جفت بازهای G-C محكم‌تر از A-T هستند. بنابراین مقاومت بیشتری در دمای 37 درجه سانتی گراد نشان می‌دهند (درجه حرارت مناسب برای پلی مرازها). یك راه حل مناسب برای مشكل ساختار ثانویه، انجام واکنش های توالی‌یابی دردمای 55 درجه سانتی گراد یا حتی بالاتر، می‌باشد. درجه حرارت بالا (تبخیری) (Elevated temperature)این نوع جفت شدن را بی ثبات كرده و DNA الگو را برای فعالیت DNA پلی مراز از هم باز می‌نماید. این راه حل فقط زمانی عملی است كه DNA پلی مراز قادر باشد در درجه حرارت بالاتر كار خود را به خوبی انجام دهد.2ـ توانایی استفاده از نوكلئوتیدهای تغییر شكل یافته به عنوان سوبستراهاقبلاً دیدیم كه چگونه خواندن ضعیف بعضی آنزیم‌ها كه توسط فعالیت اگزونوكلئازی حاصل می‌گردد، می‌تواند نوكلئوتیدهای تغییر شكل یافته را به همان سرعتی كه پلی مراز DNA آنها را اضافه می‌كند از زنجیره در حال رشد حذف نماید. مشكل مشابه دیگر زمانی بوجود می‌آید كه پلی مراز قادر به استفاده از نوكلئوتیدهای تغییر شكل یافته به عنوان سوبسترا نباشد، در این صورت آنها را نخسیتن موقعیت به رشته اضافه نمی‌كند. بعضی DNA پلی مرازها در خصوص انواع نوكلئوتیدهایی كه استفاده می‌كنند خیلی محتاط هستند و ممكن است قادر به تشخیصddNTP_s ، dITP و دیگر نمونه‌های تغییر شكل یافته نباشند. از این رو این نوع آنزیم‌های پلی مراز برای توالی یابی DNA مناسب نیستند.3ـ سرعت سنتز رشتهسرعتی كه در آن یك DNA پلی مراز، DNA جدید را سنتز می‌كند مهم می‌باشد، زیرا نمی‌خواهیم كه واکنش های سنتز رشته در یك مدت زمانی طولانی انجام گیرد. بیشتر DNA پلی مرازها متوسط سرعت سنتز 10 نوكلئوتید در یك ثانیه را دارند. از اینرو از نظر تئوری قادر به پلی مریزه كردن 500 نوكلئوتید در كمتر از یك دقیقه هستند. در عمل ممكن است این سرعت خیلی كند باشد، مخصوصاً اگر الگو دارای چندین ناحیه حلقه سنجاق سری باشد كه بواسطه توالی نوكلئوتیدی آنها سبب كند شدن سرعت پلی مراز شوند. بنابراین پلی مراز ایده‌آل توالی یابی باید یك سرعتی از طویل شدن (Elongation) (صدها نوكلئوتید در هر ثانیه) را داشته باشد.1ـ2ـ4ـ DNA پلی مرازهای مورد استفاده در توالی یابی DNA در مطالعات قبلی بیان كردیم كه DNA پلی مراز ایده آل برای توالی یابی پایاندهی زنجیره باید قدرت عمل بالایی داشته باشد، فعالیت اگزونوكلئازی آن كم باشد، در درجه حرارت‌های بالا فعال باقی بماند، قادر به استفاده از نوكلئوتیدهای تغییر شكل یافته به عنوان سوبسترا باشد و سرعت طویل شدن آن حداقل چند صد نوكلئوتید در هر ثانیه باشد.آیا چنین آنزیمی موجود است؟در واقع چندین DNA پلی مراز متمایز وجود دارد كه به قدر كافی از این معیارها برخوردار می‌باشند تا در آزمایشات توالی یابی بطور منظم استفاده شوند. یكی از این آنزیم‌های تغییر شكل یافته DNA پلی مراز T_v می‌باشد كه سكوناز نامیده می‌شود، كه آنزیم ایده‌آلی جهت توالی یابی می‌باشد. ابتدا این آنزیم را شرح داده و سپس شایستگی آنزیم‌های دیگر را بحث خواهیم نمود.1ـ3ـ دی اكسی نوكلئوتید تری فسفات‌هاهمانطوری كه می‌دانید DNA از طریق پلی مریزاسیون دی اكسی نو كلئوتیدتری فسفات‌ها (dNTP_s) (Deoxynucleotide triphosphates) سنتز می‌شود. بنابراین در یك آزمایش توالی یابی پایاندهی زنجیره هر یك از چهار dNTP_sاستاندارد (dTTP و dGTP و dCTP و dATP) در مخلوط‌های واكنش وجود دارند. اما نوكلئوتیدهای تغییر شكل یافته چگونه استفاده می‌شوند؟عموماً در توالی‌یابی پایاندهی زنجیره دو نوكلئوتید تغییر شكل یافته استفاده می‌شود (1979 Mills and Kramer، 1986 Barr et al):1ـ نوكلئوتید دی اكسی آینوزین تری فسفات.2ـ نوكلئوتید dGTP ـ deazea ـ 7.هر دو نوكلئوتید از انواع تغییر شكل یافته dGTP هستند و هر دو زمانی استفاده می‌شوند كه توالی الگو دارای ساختارهای حلقه سنجاق سری درون رشته‌ای باشد. قبلاً اثر ساختار حلقه سنجاق سری را در الگو بررسی نمودیم و بیان كردیم كه با انجام واکنش های سنتز رشته در دمای 55 درجه یا حتی 72 درجه سانتی گراد این نوع جفت شدن بازها شكسته می‌شود. این روش برای رشته الگو مناسب است اما در خصوص رشته‌های پایاندهی زنجیره كه بعداً سنتز می‌شوند چطور؟ این رشته‌های جدید مكمل الگو هستند به این معنی كه آنها توانایی زیادی در ایجاد حلقه‌های سنجاق سری دارند. این مشكل زمانی عمده می‌شود كه رشته‌های پایاندهی زنجیره با ژل پلی اكریل آمید تفكیك شوند، زیرا حلقه‌های سنجاق سری درون مولكول DNAمی‌توانند بر تحرك الكتروفورزی اثر بگذارند. به جای اینكه الگوی باندی دقیقی به دست آید برخی از باندها خیلی سریع و برخی خیلی كند حركت كرده و از هم فاصله زیادی می‌گیرند كه منجر به هم فشردگی (متراكم) ((Compressions باندها شده و توالی DNA قابل خواندن نخواهد بود. نوكلئوتیدهای تغییر شكل یافته توانایی مولکول های پایاندهی زنجیره جهت شكل گرفتن حلقه‌های سنجاق سری را كاهش می‌دهند. هیچ كدام از نوكلئوتیدهای dIITP و deazea ـ vdGTP قادر به ایجاد جفت بازهای پایدار با باقی مانده‌های C نیستند. اگر هریك از این نوكلئوتیدهای تغییر شكل یافته به جای dGTP در واکنش های سنتز رشته استفاده گردند، مولکول های به دست آمده قادر به ایجاد جفت بازهای G-C بین رشته‌ای نخواهند بود. این بدین مفهوم است كه تنها جفت بازهای A-T می‌توانند تشكیل شوند و تحت شرایط عادی به فدر كافی قوی نیستند تا حلقه‌های سنجاق سری پایدار ایجاد كنند. بنابراین فشردگی‌ها در ژل توالی‌یابی اغلب می‌تواند با استفاده از dITP و deaza ـ dGTP 7 از بین برود.پلی مرازهای سكوناز، كلئو و DNA پلی مراز Vent قادرند از نوكلئوتیدهای dITP و dGTP ـ deaza ـ 7 با كارایی متفاوت به عنوان سوبسترا استفاده نمایند. DNA پلی مراز Taq می‌تواند از deaza7 استفاده كند ولی نمی‌تواند از dITP استفاده نماید. اگر فشردگی باندها یك مشكل باشد، dITP اولین انتخاب خواهد بود، زیرا كه این نوكلئوتید منجر به نتایج بهتری نسبت به dGTP ـ deaza ـ 7 می‌شود. در عین حال نوكلئوتیدهای تغییر شكل یافته بطور معمول استفاده نمی‌شوند، چون هر دوی آنها وضوح الگو باندهای در ژل توالی‌یابی را كاهش می‌دهند.1ـ4ـ نوكلئوتید برچسب دار شده (Labelled nucleotide )بعد از اینكه رشته‌های پایاندهی زنجیره در ژل توالی یابی ران شدند نیاز است كه باندها قابل مشاهده گردند. معمولاً در استفاده از ژل آگارز از اتیدیوم بروماید (Ethidium bromide) برای رنگ آمیزی استفاده می‌شود تا باندها در زیر اشعه ماوراء بنفش قابل مشاهده باشند. اتیدیوم بروماید به DNA در ژل می‌چسبد و سپس در پاسخ به اشعه ماوراء بنفش متشعشع می‌گردد و مكان باندها آشكار می‌گردد. اگر ژل توالی یابی با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی شود ممكن است تعداد باندهای كمی مشاهده شود و میزان حساسیت و تجزیه و تحلیل برای توالی‌یابی مناسب نخواهد بود. از اینرو معمولاً در واکنش های سنتز رشته از یك نوكلئوتید برچسب دار رادیواكتیوی ((Radiolabelled nucleotide استفاده می‌شود و الگوی باندی به وسیله ی اتورادیوگرافی قابل رویت می‌گردد.یكی از دو نوكلئوتید برچسب دار زیر در واکنش های توالی یابی استفاده می‌شود:1ـ dNTP برچسب دار با ³²P در موقعیت آلفا2ـ dNTPبرچسب دار با ³⁵S با جایگزینی O بار متصل به فسفر آلفاتفاوت اصلی بین دو نوكلئوتید برچسب دار رادیواكتیو، در انتشار انرژی اتم‌های رادیواكتیو می‌باشد. ذرات بتا منتشر شده به وسیله ی ³²P تقریباً 10 برابر انر‍ژی بیشتری نسبت به ³⁵S دارند. در عمل این بدان معنی است كه:اگر از [³⁵P]dNTP استفاده شود، اتو رادیوگرافی برای مدت نسبتاً كوتاهی انجام می‌گیرد.برچسب كردن با ³⁵P باعث ایجاد باندهای تیره و نامعلوم ( (Fuzzier bands به دلیل پخش شدن در درون فیلم اشعه X می‌شود.رشته‌های برچسب دار با ³²P ناپایدار هستند، بنابراین ژل پلی اكریل آمید باید فورا بعد از واكنش های توالی یابی ران گردد. در این حالت نمی‌توان مولکول های پایاندهی زنجیره را ذخیره نموده و روز بعد مورد استفاده قرار داد.³²P نسبت به ³⁵P سلامت را بیشتر به خطر می‌اندازد.علاوه بر ³²P و ³⁵S اخیراً نوكلئوتیدهای ³³P نیز قابل دسترس شده‌اند. انتشار انر‍ژی ³³P بین مقادیر ³²P و ³⁵S می‌باشد. (Mev 71/1، MeV 249/0، ³³P - Mev167/0 ، ³⁵S). این بدان معنی است كه ³²P دارای فواید ³⁵S است به جز اینكه زمان آشكار سازی كمتری را نیاز دارد.از اینرو بیشتر آزمایشات توالی یابی با [³⁵S]dNTP انجام می‌شود. در این حالت اتورادیوگرافی باید برای مدت طولانی‌تری صورت گیرد اما به طور كلی نتایج بهتری به دست می‌آید. یك نوع برچسب‌دار از هریك از چهار dNTP ها می‌توانند در واکنش های توالی یابی استفاده شوند، اما dGTP را با dITP یا dGTP ـ deazaـ 7 جایگزین كنید. بهترین شاخص جهت انتخاب و استفاده از یك نوكلئوتید برچسب دار رادیواكتیو محتوای GC مولكول DNA مورد توالی یابی می‌باشد. اگر محتوای GC بالا باشد بهتر است از dCTP برچسب دار استفاده شود در صورتیكه اگر این مقدار پایین باشد از dATP برچسب دار استفاده می‌شود. از این طریق بیشترین میزان برچسب در هریك از مولکول های پایاندهی زنجیره درج می‌گردد و زمان لازم برای اتورادیوگرافی كاهش می‌یابد.1ـ5ـ نوكلئوتید پایان دهی زنجیرهمعرفی دی دزوكسی نوكلئوتیدها (ddNTP_s) یكی از ابداع های كلیدی بود كه توالی پایاندهی زنجیره را بسیار موثر نمود (1977Sanger et al ) یك ddNTP فاقد گرون هیدروكسیل ( (Hydroxyl group متصل به كربن 3 پرین در تشكیل پیوند فسفودی استر (Posphodiester) شركت می‌كند، اما بدون گروه هیدروكسیل واكنش نمی تواند ادامه پیدا كند. بنابراین درج یك ddNTP مانع طویل شدن رشته می‌شود. در حقیقت تنها راه ادامه طویل شدن، حذف دی دزوكسی نوكلئوتید از رشته ‌DNA می‌باشد. اگر آنزیم توالی‌یابی فاقد فعالیت اگزونوكلئازی 3 پرین به 5 پرین باشد، حذف دی دزوكسی نوكلئوتید غیر ممكن خواهد بود و بنابراین زنجیره پایان یافته باقی می‌ماند.واکنش های توالی یابیشما DNA الگو را تهیه كرده‌اید و اجزاء واكنش توالی یابی را فراهم نموده‌اید. اكنون باید آنها را با هم مخلوط نمائید تا رشته‌های DNA پایان دهی زنجیره ساخته شوند. چندین روش مختلف برای انجام دادن واكنش های سنتز رشته وجود دارد. ابتدا عمومی ترین روشی یعنی روش پایان دهی برچسب دار (Labelling – termination) توضیح داده می‌شود (b1987. Taborand Richardson). 2ـ1ـ روش پایان دهی برچسب دار (برچسب دار كردن انتهایی): دو مرحله اصلی در این روش وجود دارد.2ـ1ـ1ـ اتصال پرایمر به الگوادامه دادن (بسط دادن) پرایمر چسبیده از طریق سنتز رشته، جهت تولید مولکول های پایان دهی زنجیره.آزمایش می‌تواند در لوله‌های میكروفوژ پلی پروپیلن (Polypropylen microfuge tubes) (با اندازه های 5/0 یا 5/1 میلی لیتر) انجام گیرد. اگر هدف تعیین توالی چندین الگو به طور همزمان باشد؛ از سینی (طبق) میكروتایتر 96 چاهكی (96-Well-Microtitre tray) استفاده می‌شود. سینی میكروتایتر باید ته گرد باشد. همچنین به یك استوانه چرخان مخصوص در محل بالای سانتریفوژ نیاز خواهد داشت تا با چرخانیدن سینی معرف ها با هم مخلوط شوند. 2ـ1ـ2ـ چسباندن پرایمرمرحله نخست هر روش توالی یابی پایان دهی زنجیره چسباندن پرایمر الیگونوكلئوتید به مولكول DNA الگو است. هنگامی كه این مرحله را انجام می دهید؛ دستیابی به دو چیز باید مد نظر باشد:1ـ تخصصی بودن اتصال پرایمر (Specificity) 2ـ كارایی اتصال پرایمر (Efficiency)1ـ تخصصی بودن اتصال پرایمرتخصصی بودن به این معنی است كه پرایمر بایستی فقط به مكان مورد نظر (پایین دست ناحیه ای كه قرار است توالی یابی شود) در الگو بچسبد. اگر پرایمر به مكان های دیگر نیز بچسبد؛ بیش از یك سری از مولکول های پایان دهی زنجیره تولید خواهد شد، و در آن واحد، دو توالی به دست خواهد آمد و خواندن توالی را دچار مشكل خواهد كرد.معمولأ توالی تولید شده از مكان ثانویه اتصال پرایمر ضعیف‌تر از تولای اصلی است، از این رو باندهای غیر مستعمل (مرده) در اتورادیوگرافی به دست می‌آید. بعضی مواقع این باندهای مرده به قدری ضعیف هستند كه توالی واقعی بدون زحمت قابل خواندن خواهد بود، اما در صورت باید از آن اجتناب شود. 2ـ2ـ روش های جایگزین روش پایان دهی ـ برچسب دارروش پایان دهی ـ برچسب دار بهترین انتخاب برای توالی یابی یك الگو DNA تك رشته ای با یك آنزیم با قدرت عمل بالا نظیر سكوناز می‌باشد. در عین حال روش های دیگر توالی یابی پایان دهی زنجیره نیز وجود دارد كه ممكن است در برخی موارد استفاده شوند. سه مورد از این روش ها به شرح ذیل می‌باشند. 2ـ2ـ1ـ روش دنباله ـ پایان دهی (Termination – chase) با پلی مراز كلنوقبل از این که آنزیم های سكوناز قابل دسترس باشند؛ توالی پایان دهی زنجیره با پلی مراز كلنو انجام می‌گیرد. این آنزیم قدرت عمل نسبتاً پایینی داشت و در بهترین حالت در یك آزمایش، 200 تا 300 جفت باز را بلافاصله بعد از مكان اتصال پرایمر توالی یابی می نمود. روش دنباله پایان دهی نیز مانند روش های گسترش ـ برچسب دار (Labelling -extension ) و نوكلئوتید برچسب دار رادیو اكتیو می باشد و تنها تفاوت‌هایی در واکنش های سنتز رشته دیده می‌شود. دوابره چهار واكنش به طور موازی انجام می‌گردد اما در این حالت ddNTP_sاز شروع واكنش وجود دارند. مرحله برچسب دار كردن ابتدایی با dNTP_s وجود ندارد؛ بلكه برچسب دار كردن و پایان دهی زنجیره در یك مخلوط واكنش اتفاق می افتد. بعد از نخستین پرورش dNTP های اضافی به منظور ادامه واكنش اضافه می‌گردند. به نظر می‌رسد كه هریك از رشته‌هایی كه با ddNTP پایان نیافته‌اند؛ اكنون تا حد امكان گسترش می‌یابند و اندازه های بزرگ تر از 300 جفت باز را ایجاد می‌كنند. بنابراین تمامی مولکول های كمتر از 300 جفت باز در ژل توالی یابی، به واسطه وجود ddNTP پایان یافته‌اند تا به واسطه تمام شدن dNTP ها. مولکول های متوقف شده باندهای شبه مانندی را در ژل پلی اكریل آمید تولید می‌نمایند و خواندن توالی‌یابی را مشكل می‌سازند.با روش دنباله ـ پایان دهی فرصت كمتری برای هماهنگ نمودن شرایط واكنش جهت حصول نیازهای مخصوص وجود دارد. این روش تنها می‌تواند 300 جفت باز توالی نزدیك به اتصال پرایمر را مشخص نماید. با وجود این اغلب جایگزین مناسبی نسبت به روش گسترش برچسب‌دار جهت توالی یابی مكان خیلی نزدیك به محل اتصال پرایمر می‌باشد. 2ـ2ـ2ـ توالی یابی الگوهای DNA دو رشته‌ایهمچنان كه ذكر گردید؛ ‌روش های پیچیده‌ای برای توالی یابی DNA تك رشته‌ای، از طریق توالی یابی پایان دهی زنجیره، مورد نیاز می‌باشد. ممكن است از خودتان سؤال كنید آیا می‌توان از این روش ها با استفاده نمودن از DNA دو رشته‌ای (به عنوان الگو) اجتناب نمود؟ در حقیقت اگر بتوانیم DNA دو رشته‌ای را توالی یابی كنیم؛ پس نیازی به كلون كردن DNA در ناقل های M₁₃ و فاژمید نخواهیم داشت و به جای آن قادر خواهیم بود به راحتی از پلاسمید یا سیستم‌های باكتریوفاژ لاندا استفاده كنیم. اگر چه توالی یابی DNA دو رشته‌ای جای تقدیر زیاد دارد و تلاش های زیادی جهت توسعه این روش انجام گرفته است؛ اما حتی امروزه نتایج توالی یابی دو رشته‌ای قابل مقایسه با روش های تك رشته‌ای نیستند. خواندن توالی‌های تولید شده از DNA دو رشته‌ای مشكل می‌باشد و همچنین توالی‌یابی بیش از 200 جفت باز به ندرت امكان پذیر می‌باشد. مشكل اصلی در این جا كیفیت DNA تهیه شده می‌باشد، ذرات فاژی M₁₃ ، DNA خیلی مناسبی را فراهم می‌نمایند. چنان چه كشت آلوده به درستی رشد كرده باشد؛ آلودگی سلولی مقدار كمی از سوسپانسیون فاژی به عنوان مواد شروع كننده وجود خواهد داشت. جهت به دست آوردن DNA الگوی خالص باید پوشش پروتئین فاژی را حذف نمود. برخلاف این، تهیه DNA پلاسمید با شكستن و باز شدن سلول های باكتریایی میزبان درگیر است و از لاندا DNA زمانی به عنوان مواد شروع كننده یك كشت استفاده می‌شود كه در آن توده‌ای از باكتری‌های به وسیله باكتریوفاژلیز شده باشند.در هردو مورد شما با مخلوط‌های بسیار پیچیده‌ای جهت خالص سازی الگو روبرو هستید. همچنین حذف تمام آلوده كننده‌ها كار بسیار مشكلی خواهد بود. پلی مراز كلنو به آلودگی بسیار حساس می‌باشد. از اینرو هرگز نباید با یك الگو دو رشته‌ای استفاده گردد. در حالی كه پلی مراز سكوناز كمتر حساس می‌باشد و می‌تواند توالی‌های كوچكی از DNA دو رشته‌ای را تولید نماید. اما باید مطمئن شوید كه DNA الگو کاملأ خالص است. به عنوان مثال الوده كننده‌های RNA می‌توانند به الگو DNA چسبیده و باعث شروع واکنش های سنتز رشته گردند، به این طریق خواندن توالی در ژل پلی اكریل آمید دچار مشكل خواهد شد. در استفاده از پلاسمیدها باید خالص سازی كامل با كلرید سزیم در مرحله شیب دانسیته (Debsuty gradient step) انجام گیرد، یا اگر از یك مینی پرپ استفاده می‌كنید، باید دقت كنید كه RNA باقی ماند به وسیله هضم ریبونوكلئازی (Ribonuclease digestion) یا رسوب كلرید لیتیم (Kutium chloride precipitaiton) حذف گردد.هنگامی كه الگو دو رشته‌ای بسیار خالص را تهیه كردید شما می‌توانید روش پایان دهی برچسب دار استاندارد را، جهت به دست آوردن یك توالی، ادامه دهید. البته باید قبل از اتصال پرایمر، DNA دو رشته‌ای به طور كامل دناتوره شود. این عمل با تیمار كردن با ماده قلیایی (Alkali) یا جوشاندن (Boiling) به دست می‌آید. به طوری كه جفت بازهای میان دو رشته شكسته شده و نواحی تك رشته‌ای مناسب برای اتصال پرایمر را فراهم می‌سازد. 2ـ2ـ3ـ توالی یابی سیكل حرارتی (Thermal cycle sequencing)توالی یابی حرارتی یك روشی است كه از آنزیم‌های مقاوم در برابر حرارت نظیر DNA پلی مراز Taq در روشی كه برای توالی یابی قطعات DNA به وسیله تكثیر PCR طراحی شده استفاده می‌كند. در حقیقت به دست آوردن الگوی تك رشته‌ای برای توالی یابی پایان دهی زنجیره از طریق تولیدات PCR وقت‌گیر می‌باشد. اما در استفاده از روش توالی‌یابی سیكل حرارتی كه قادر به توالی یابی تولیدات PCR به طور مستقیم می‌باشد این مشكل حل خواهد گردید. روش توالی یابی سیكل حرارتی شامل مراحل زیر می‌باشد:بعد از نخستین آزمایش PCR، پرایمرهای باقی مانده از DNA تكثیر شده را به وسیله كروماتوگرافی ستونی حذف نمایید. سپس بخشی از DNA تكثیر شده را به عنوان مواد شروع كننده جهت تكثیر دوم استفاده كنید، اما در این زمان شما فقط یكی از دو پرایمرهای PCR را به همراه ddNTP ها در واكنش استفاده نمائید. در طول مدت سیكل حرارتی، پلی مراز مقاوم به حرارت یك رشته از DNA تكثیر شده را به عنوان الگو جهت توالی یابی مورد تیمار قرار می‌دهد و مولکول های پایان دهی زنجیره سنتز می‌شوند تا الگوی باندی مورد نیاز در ژل توالی‌یابی فراهم شود. می‌توانید از یك نوكلئوتید برچسب‌دار در واكنش استفاده كنید اما معمولأ نتایج بهتری در استفاده از پرایمرهای با انتهای برچسب دار به دست می‌آید. از آنجائیكه حذف كامل پرایمرها از نخستین PCR مشكل می‌باشد، از اینرو برخی مولکول های پایان دهی زنجیره توالی رشته دومی كه تولید شده است را نشان می‌دهند.اگر پرایمر توالی‌یاب در انتها برچسب‌دار باشد، مولکول های ناخواسته در اتورادیوگرافی قابل رؤیت نخواهند بود و می‌توان از آنها صرفنظر كرد. چنانچه نخستین PCRشما محصول تك رشته‌ای تولید نماید، توالی سیكل حرارتی به خوبی كار خواهد كرد. در این حالت هنگامی كه نتایج در ژل آگارز تجریه گردد، فقط یك باند مشاهده می‌شود. اگر PCR باندهای اضافی تولید نماید پس باید محصول PCR مودر نظر از ژل آگارز قبل از انجام واکنش های توالی یابی خالص گردد. روش سیكل حرارتی همچنین جهت توالی یابی مقادیر كوچكی از پلاسمید دو رشته‌ای و الگوهای لاندا (به طور مثال از یك كلونی یا پلاك) استفاده می‌شود، اما مانند توالی یابی DNA دو رشته‌ای باید DNA آنها کاملأ از مواد آلوده كننده مبرا باشد. توالی یابی پایان دهی زنجیره (ران كردن ژل و خواندن توالی)در پایان واکنش های سنتز رشته چهار خانواده از مولکول های پایان دهی به دست می‌آید. در یك خانواده همه مولکول ها به A ختم می‌شوند. در دیگری به C، در سومی به G و در چهارمین خانواده به T ختم می‌گردند.شما اكنون باید این مولکول ها را در یك ژل پلی اكریل آمید به منظور به دست آوردن الگوی باندی و در نتیجه توالی یابی DNA جدا نمایید. انجام این كار شامل مراحل زیر می‌باشد:1ـ الكتروفورز ژل (بخش 1): تهیه ژل پلی اكریل آمید، لود كردن نمونه‌ها، ران كردن ژل و به دست آوردن اتورادیوگراف (فرض كنید كه از یك برچسب رادیواكتیو استفاده كرده‌اید)2ـ خواندن توالی (بخش2): تفسیر الگوی باندی در اتورادیوگرافی3ـ آنالیز توالی (بخش 3): استفاده از توالی‌های انفرادی به دست آمده از آزمایشات مختلف جهت تهیه یك توالی عظیم پیوسته (Contiguous master sequence)، شناسایی چهارچوبهای خواندن باز (ORF_s) (Open reading frames) و دیگر موتیف‌های ژنتیكی (Genetic Motifs)، و بررسی اطلاعات پایه (بانك‌های اطلاعاتی) (Detabases) مرتبط با توالی‌ها این فصل شما را با این سه مرحله آشنا می‌سازد. -41ـ ژل توالی یابیاگر برای اولین بار ژل می‌ریزید؛ در استفاده از ژل های توالی یاب، به طور حتم با مشكلات زیادی مواجه خواهید شد و ممكن است سختی قبول كنید كه ژل های توالی یابی كم و بیش آخرین تكنولوژی مرسوم الكتروفورز ژل را نمایش می‌دهند. برای اینكه توالی‌یابی موفقیت آمیز باشد؛ باید امكان جداسازی مولکول های DNA با اندازه های متفاوت (حتی با تفاوت یك نوكلئوتید) وجود داشته باشد. در استفاده از خانواده‌های مولکول های پایان دهی زنجیره جهت توالی یابی الگو، این مورد اهمیت زیادی دارد. جداسازی یك مولكول DNA مثلا با 147 نوكلئوتید از مولكول دیگر با 146 یا 148 نوكلئوتید آسان نیست؛ اما از طریق استفاده از الكتروفورژل های پلی آكریل آمید با وضوح بسیار بالا امكان پذیر می‌باشد. در بخش های بعدی این موضوع شرح داده خواهد شد.1ـ1ـ طی عمل الكتروفورز ژل چه اتفاقی رخ می‌دهد؟مولکول های DNA مانند پروتئین‌ها و بسیاری از تركیبات بیولوژی دیگر دارای بار الكتریكی می‌باشند (بار DNA منفی می‌باشد). این بدان مفهوم است كه وقتی مولکول های DNA در یك میدان الكتریكی (Electric field) قرار می‌گیرند به سمت قطب مثبت حركت می‌نمایند. این فرآیند الكتروفورز نامیده می‌شود. روش های مرسوم الكتروفورز در فار محلول (Solution phase) انجام می‌شوند. تحت این شرایط میزان حركت یك مولكول به دو عامل شكل و نسبت بار به جرم مولکول ها وابسته می‌باشد. از آنجایی كه شكل (معمولاً خطی) و نسبت بار به جرم بیشتر مولکول های DNA یكسان می باشد؛ از این رو مولکول های DNA با طول های متفاوت نمی‌توانند به طور مؤثر توسط روش های مرسوم الكتروفورز جدا شوند. با وجود این اگر الكتروفورز در یك ژل آگارز یا پلی اكریل آمید انجام گیرد؛ طول مولكول DNA یك عامل مهم در الكترو فورز محسوب می‌شود. یك ژل، متشكل از شبكه پیچیده‌ای از منافذ می‌باشد كه مولکول های DNA جهت رسیدن به الكترود مثبت از آن باید عبور نمایند. مولکول های كوتاه تر DNA سریع تر از منافذ ژل عبور كرده و به سمت قطب مثبت حركت می‌نمایند. از این رو الكتروفورز ژل، مولکول های DNA را بر حسب طول آنها جدا می‌سازد. وضوح و اندازه مولکول هایی كه جدا می‌شوند وابسته به اندازه منافذ ژل می‌باشند. جهت توالی یابی نیاز به تفكیك در حد یك نوكلئوتید و همچنین نیاز به جداسازی مولکول های با طول حدود 20 تا 1000 نوكلئوتید می‌باشد. این كار با ژل آگارز امكان پذیر نیست. چون منافذ آن خیلی بزرگ می‌باشند. از این رو شما مجبورید كه از ژل پلی اكریل آمید استفاده كنید.وابسته بودن حركت مولكول DNA به شكل آن، دلیل مشكل ساز بودن ساختاری حلقه سنجاق سری می‌باشد.1ـ2ـ چگونه ژل پلی اكریل آمید را به كار می‌برید؟ژل های پلی اكریل آمید با پلی مریزه شدن (Polymerizatio) مونومرهای اكریل آمید در زنجیره‌های طولانی و اتصال از طریق واحدهای methylenebisacrylamide ـ N و N پریم تشكیل می‌شوند. اندازه منفذ (سوراخ) ژل به وسیله غلظت مونومرهای اكریل آمید در محلول پلی مریزاسیون تعیین می‌گردد (1991 Andrews) عموماً جهت توالی یابی DNA از ژل 6% استفاده می‌شود. این نوع ژل مولکول های با اندازه 500 ـ 25 نوكلئوتید را تجزیه می‌نماید. چنان چه شما مایل به خواندن یك توالی خیلی نزدیك به پرایمر باشید؛ باید غلظت ژل را به 8% افزایش دهید. همچنین اگر قصد دارید كه یك توالی با بیش از 500 نوكلئوتید را گسترش دهید؛ باید غلظت ژل را به 5 یا حتی 4% كاهش دهید.لودكردن نمونه‌هاهنگامی كه در نوشته های قبلی واكنش های سنتز رشته را به حال خود باقی گذاشتیم؛ فقط مخلوط رنگی فورمامید را به هر نمونه اضافه كردیم. قبل از این كه نمونه‌ها را لود كنید؛ باید واكنش ها را در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 2 دقیقه پرورش دهید تا مولکول های پایان دهی زنجیره از DNA الگو جدا شوند. سپس نمونه‌ها را در یخ قرار داده و 2 تا 4 میکرولیتر از هر واكنش را در چاهك‌ها به دقت لود كنید. این كار چندان هم آسان نیست. فاصله بین صفحات كمتر از نیم میلی‌متر می‌باشد. از این رو یك پیپت نوك دار معمولی برای داخل كردن در چاهك ها مناسب نیست. چهار روش برای انجام این كار وجود دارد:1) استفاده از یك پیپت نوك‌دار مخصوص با انتهای كشیده2) استفاده از یك لوله مویی كشیده (Capillary tube)3) استفاده از سرنگ 30 یا سرنگ باریك تر4) استفاده از یك پیپت نوك‌دار معمولی كه به وسیله آن نمونه به طور عمودی به داخل چاهك چكانده شود.روش آخر، بهترین روش است زیرا خسارت های وارد شده به چاهك را در مدت لود كردن كاهش می‌دهد. در لود كردن هیچ وقت نباید عجله كنید؛ اما سعی كنید كه لود كردن در 2 دقیقه تمام شود. ترتیب لود كردن نمونه‌ها مهم نیست؛ اگرچه ترتیب الفبایی (A-C-G-T) عمومی‌ترین حالت است؛ اما ممكن است شما آن را تغییر دهید. اگر DNA الگوی شما دارای مقادیر بالای AT یا غنی از GC باشد؛ ترتیب A-T-G-C بهتر خواهد بود زیرا دو مسیر با اكثریت باندها (T و A یا C و G) در كنار همدیگر خواهند بود.ران كردن ژلبه محض این كه آخرین نمونه را لود كردید؛ دستگاه را به منبع جریان (Power supply) وصل كنید و آن را روشن نمایید. محل استقرار دستگاهی كه استفاده می‌كنید به ابعاد (Dimensions) ژل بستگی دارد. توجه داشته باشید كه ولتاژ دستگاه بسیار بالا می‌باشد و می‌تواند فرد را در جا بكشد!!! از این رو هرگز با دستگاهی كه روشن است بازی نكنید و از دستگاهی كه مخزن آن نشت دارد استفاده نكنید. ولتاژ مناسب 45 ولت بر سانتی متر می‌باشد.شما می‌توانید پیشرفت الكتروفورزی را با مشاهده مهاجرت (حركت) دو رنگ برومو فنول آبی و سیانول گزیلن در پایان ژل دنبال كنید. میزان حركت این رنگ ها بستگی به غلظت اكریل آمید در ژل دارد. در یك ژل 6%، رنگ آبی بروموفنول (رنگی كه سریعتر حركت می‌كند) به میزان یكسانی مانند یك مولكول DNA تك رشته‌ای كه 25 نوكلئوتید طول دارد حركت می‌نماید. در این ژل سیانول گزیلن مانند یك مولكول 100 نوكلئوتیدی حركت می‌نماید. بنابراین شما می‌توانید طولی از ران شدن (جهت توالی یابی) كه مورد نظرتان است را مشخص نمایید. اگر شما بخواهید توالی نزدیك به پرایمر را بخوانید؛ پس هنگامی كه بروموفنول به فاصله چند سانتی متری از پایین ژل می‌رسد الكتروفورز را متوقف كنید؛ كه معمولاً این حالت نزدیك به 2 ساعت وقت می‌برد. اگر بخواهید توالی دور از پرایمر را بخوانید؛ ژل را برای مدت طولانی‌تری ران كنید. اگر چاهك هایی را یدك نگه داشته‌اید؛ می‌‌توانید در یك نقطه مشخص الكتروفورز را متوقف نمایید و سپس قسمت دوم هر یك از نمونه‌ها را لود كنید و دوباره دستگاه را روشن كنید. در این حالت یك ران بلند مدت و كوتاه مدت از همان توالی به دست می‌آید.برخی پروتكل‌ها توصیه می‌نمایند كه قبل از لود كردن، ژل را باید با یك پیش الكتروفورز (در همان ولتاژی كه برای الكتروفورز استفاده می‌شود)، برای مدت 30 دقیقه یا بیشتر گرم نمود. -53ـ واكنش های قطع شیمیاییوقتی DNA را تهیه كردید؛ می‌توانید آن را در واكنش های قطع شیمیایی استفاده نمایید و خانواده‌هایی از مولكول های شكسته شده را به دست آورید تا بعداً در ژل توالی‌یابی لود گردند. واکنش های قطع شیمیایی در دو مرحله انجام می‌شوند. نخست DNA با یك ماده شیمیایی كه یك باز نوكلئوتید را تغییر می‌دهد تیمار می‌گردد. سپس پی پریدین اضافه می‌شود تا DNA را در مكان تغییر یافته برش دهد. این دو مرحله به طور كامل توضیح داده می‌شود.3ـ1ـ واکنش های تغییر نوكلئوتیدچنانچه روش توالی یابی معمولی را دنبال می‌كنید؛ DNA را به چهار قسمت تقسیم نموده و لوله‌هایی را به شرح ذیل تیمار نمایید:لوله 1: دی متیل سولفات اضافه كنید (واكنش G).لوله 2: اسید فرمیك اضافه كنید (واكنش A+G).لوله 3: هیدرازین اضافه كنید (واكنش C+T)لوله 4: NaCl به همراه هیدرازین اضافه كنید (واكنش C).هنگامی كه تصمیم گرفتید كه چه مقدار DNA استفاده كنید؛ عامل مهم میزان برچسب‌دار كردن خواهد بود. دو نمونه از واكنش ها به طور كامل مختص یك باز نیستند. ثابت شده است كه طراحی واکنش های كه هر باز را به صورت انفرادی تشخیص بدهند غیر ممكن می‌باشد. از این رو در این روش دو مورد از واکنش ها فامیل‌های مخلوط شده‌ای از مولكول ها، شامل یك خانواده A+G و یك خانواده C+T را به وجود می‌آورند. معمولاً این حالت، در خواندن ژل توالی یابی هیچ مشكلی ایجاد نمی‌كند. اگر بخواهید می‌توانید واكنش پنجم را نیز انجام دهید (با NaOH به همراه EDTA جدول 1ـ5) كه در آن در نوكلئوتیدهای A و C شكسته می‌شود. البته با ارجحیت نهادن به نوكلئوتیدهای A این واكنش A>C برای شما یك مسیر پنجم را در ژل توالی یابی فراهم می‌نماید و كمك می‌نماید تا هرگونه آشفتگی در ژل واضح گردد. البته اكثر اوقات این واكنش اضافی نیاز نمی باشد.روش استاندارد عمومی‌ترین روش قطع شیمیایی است، البته در چند سال گذشته تغییراتی نیز در این روش ایجاد شده است (1987 Ambrose and Pless) به عنوان مثال یكی از اهداف، جایگزینی مواد شیمیایی كم خطرتر به جای مواد شیمیایی خطرناك بوده است. اما روش استاندارد هنوز به طور گسترده استفاده می‌شود. هر تغییری بعد از چند دقیقه در دمای 25 درجه سانتی گراد كامل می‌شود. از این رو با اضافه كردن یك بافر استات (Acetate buffer) (فرمول دقیق آن به واكنش بستگی دارد) واكنش متوقف می‌شود و DNA با رسوب كردن اتانول بازیافت می‌گردد. اكنون همه چیز جهت انجام مرحله دوم آماده می‌باشد.جدول 1ـ5ـ واكنش های تغییر نوكلئوتیدی مورد استفاده در توالی یابی قطع شیمیایی

معرف واكنش
دی متیل سولفات	G
اسید فورمامید	A+G
هیدارزین	C+T
NaCl + هیدرازین	C
NaOH+EDTA	A>C
NaOH	A>C تغییر یافته
پتاسیم پرمنگنات	T

3ـ2ـ شكستگی رشتهجهت ایجاد شكستگی در رشته، پلت‌های DNA مربوط به رسوب اتانول را در 1M پی‌پریدین مجددا سوسپانسیون نمائید و برای مدت 30 دقیقه در درجه حرارت 90 درجه پرورش دهید. در مدت این پرورش بازهای تغییر شكل یافته پورین و پریمیدن از پلی نوكلئوتیدها حذف می‌شوند، و هر رشته بلافاصله در بالادست موقعیت باز از دست رفته در پیوند فسفودی استرشكسته می‌شود. نكته اساسی در این مرحله این است كه واکنش های شكستگی به طور كامل انجام شوند. چنانچه تعدادی از مكان های تغییر شكل یافته بدون شكستگی باقی بمانند؛ تعداد زیادی از پلی نوكلئوتید با طول كامل در مخلوط‌های واكنش وجود خواهد داشت. در این حالت مولكول های شكسته شده كمتری به دست آمده و در نتیجه باندها در اتورادیوگراف ضعیف و غیر متمایز خواهند بود. پرورش به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت 90 درجه جهت شكستگی كامل واکنش ها زمان مناسبی می‌باشد، اما باید مطمئن باشید كه لوله‌ها محكم بسته شده‌اند تا پی پریدین تبخیر نشود. از دست رفتن پی پریدین ممكن است باعث انجام یك واكنش ناقص شود. بعد از پرورش دادن، پی‌پریدین با یك تبخیر كننده دوار (Rotary evaporator) حذف می‌شود و نمونه های DNA در یك بافرلود كننده (Loading buffer) مجدداً سوسپانسیون گردیده و جهت الكتروفورز در ژل توالی یابی آماده می‌شوند.احتیاط: پی‌پریدین به راحتی شعله‌ور می‌گردد و با استنشاق و تماس با پوست سمیت ایجاد می‌كند. توجه كنید كه محلول های ذخیره پی‌پریدین (معمولاً M10) بیشتر پلاستیك ها را حل می‌نمایند. از این رو نباید در بطری های پلاستیكی نگهداری شوند.

شنبه 21/5/1391 - 17:39

[ نظر به این مطلب ] - [ نظرات این مطلب : 8 ]

دنیای گیاهان و حیوانات

درختان و درختچه ها دارویی

درخت کاکائو: Scientific name: Theobroma cacaoLatine name: cacaoاز خانواده Sterculiaceae جنس Theobroma می باشد.گستره:مکزیک و آمریکای مرکزیویژگیهای فیزیکی:درخت کوچکی است که طول ساقه های آن در نمونه های پرورش یافته به ارتفاع پنج تا شش متر ولی در انواع وحشی به 10 تا 12 متر می رسد. دارای برگ های بزرگ، منفرد، با دمبرگ کوتاه، بی کرک، شفاف و شامل دو استیپول کوچک (زایده زیر برگ) و زود افت می باشد. گلهای آن کوچک، به رنگ مایل به قرمز، فاقد بو و مجتمع است که بر روی تنه ی درخت یا شاخه های مسن و همچنین شاخه های جوان ظاهر میگردد. هر گل آن شامل پنج کاسبرگ گلبرگ مانند، پنج گلبرگ، 10 پرچم (پنج پرچم زایا و پنج پرچم فاقد بساک) است. تخمدان آن آزاد، مرکب از پنچ خانه و میوه اش دراز، بیضوی، بصورت نوعی سته، به رنگ زرد یا قرمز، ناشکوفا دارای برجستگی های مشخص طولی است. قسمت گوشتدار میوه آن، برنگ تقریبا زرد، دارای حالت نیمه روان، ترش مزه و محتوی 20 تا 40 دانه است. غشای دانه های آن در حالت تازه، نرم و به رنگ مایل به سفید است ولی پس از خشک شدن، به رنگ قرمز تیره در می آید. دانه کاکائو به درازای دو تا سه سانتی متر، به عرض 5/1 سانتی متر و به رنگ قهوه ای مایل به قرمز می باشد. بادام درون آن، رنگ قهوه ای، قرمز یا مایل به بنفش یا سیاه مایل به آبی و روغن فراوان دارد. سطح خارجی آن از یک غشای نازک آلبومن پوشیده شده است. این غشا انشعاباتی به داخل می فرستد بطوری که آنرا به چند لوب تقسیم می کند.لپه های آن حجیم، بوی آن ضعیف، طعمش کمی تلخ، مطبوع و معطر است. دانه های آن تحت نام کاکائو در بازرگانی عرضه می شود و مورد استفاده قرار می گیرد. کاربرد دارویی:دانه کاکائو دارای بادامی است که88%وزن آن را تشکیل می دهد. بادام دانه شامل 49 تا 59% ماده چرب (بوردو کاکائوbearve de cacuo) هشت تا 10% آمیدون، 11 تا 18 درصد مواد ازته، یک تا سه درصد تئوبرومن (theobromin) همراه با کافئین، دو تا سه درصد از یک نان نوگلوکزید مخصوص به نام کاکائونین (cacaonin) چهار تا شش درصد سلولز، سه تا چهار درصد مواد معدنی و فرمانهای مختلف است.از تجزیه کاکائونین، قرمز کاکائوrougede cacao و گلوکز بدست می آید. تئوبرومین، علاوه بر مغز دانه، در پوسته ی آن، در برون میوه و در برگهای جوان گیاه یافت می شود .گرد کاکائو، به مصارف شکلات و فراورده ای دارویی مختلف مانند شرابهای مقوی وغیره میرسد بعلاوه منشا تهیه بوردو کاکائواست. از بوردو کاکائو، به صورت اکسیدان برای تهیه شیاف، پماد و غیره استفاده میشود.پوست دانه کاکائو به مصارف تهیه تئوبرومن میرسد. بعلاوه دو کره آن به عنوان یک نوشابه مقوی غالبا مصرف می گردد.تئوبرومن موجود در دانه کاکائو اثری مدر دارد واز دسته مدرهای مستقیم است. حداکثر مصرف آن یک گرم در هر دفعه و سه گرم در 24 ساعت است.

شنبه 21/5/1391 - 17:37

[ نظر به این مطلب ] - [ نظرات این مطلب : 0 ]

دنیای گیاهان و حیوانات

درختان و درختچه ها دارویی

غان:Scientific name: Betula lentaLatine name: Cherry Birch(روغن اسانس دار پوست غان 97 تا 99% متیل سالیسیلات دارد، آن هم از راه پوست جذب می شود و اگر خورده شود خیلی سمی می باشد. 4700 میلی گرم آن یک کودک را می کشد.)از خانواده Betulaceae ، جنس Betula می باشد.گستره:آمریکای شمال شرقی. (ملک شادخت و فولاد1387)ویژگیهای فیزیکی:درخت برگ ریز تا 24 متر رشد می کند. گلدهی در فروردین و رسیدگی بذر در مهرماه صورت می گیرد. گلها یک پایه و گرده افشانی بوسیله باد صورت می گیرد. غان در خاکهای شنی، لومی، رسی و خیلی رسی با زهکش خوب رشد می کند. در ضمن در خاکهای اسیدی، خیلی اسیدی، خنثی و قلیایی هم رشد می کند. این گیاه در محیط بدون سایه و تا حدی سایه رشد می کند. (ملک شادخت و فولاد1387)کاربرد دارویی:پوست غان کرم کش، داروی قابض، معرق، ادرارآور و محرک می باشد. چایی که از پوست آن می سازند در درمان تب و بیماریهای ریه و معده بکار می رود. روغن اسانس داری که از پوست می گیرند در درمان رماتیسم و عفونتهای مثانه بکار می رود. برگها را جویده که باعث خوب شدن اسهال می شود. (ملک شادخت و فولاد1387)برگ های آن را حدودا دو ماه پس از روییدن می چینند و در سایه یا خشک کن با حداکثر 40 درجه سانتیگراد حرارت خشک می کنند. داروی بدست آمده حاوی ساپونین، تانن، اسانس های روغنی، رزین و مواد ضد عفونی کننده گیاهی است. این گیاه معطر و تلخ مزه است. (ولاگ و استودولا 1382 )جزئیات کاشت:غان در خاک لومی با زهکش خوب و یک محیط محافظت شده بهتر رشد می کند. خاک مرطوب را دوست ندارد. این گیاه در محیط با بارندگی سالیانه 60 تا 150 سانتی متر، میانگین دمای 5 تا 12 درجه سانتی گراد و ph 5/4 تا 5/7 رشد می کند. (ملک شادخت و فولاد1387)تکثیر:بذر را تا موقعیکه برسد در شاسی سرد و در یک محیط آفتابی پرورش بدهید. بذرپاشی باید سطحی باشد. وقتی گیاه به قدر کافی بزرگ شد آنها را در گلدانهای مجزا درون شاسی سرد بکارید تا زمستانگذرانی صورت بگیرد. گیاه را در واخر بهار یا اوایل تابستان بعد از سمرای بهاره به زمین اصلی انتقال بدهید. (ملک شادخت و فولاد1387)

شنبه 21/5/1391 - 17:36

[ نظر به این مطلب ] - [ نظرات این مطلب : 0 ]

دنیای گیاهان و حیوانات

درختان و درختچه ها دارویی

ارمک:nevadensis Scientific name: EphedraLatine name: Mormon Teaاز خانواده Ephedraceae، جنس Ephedra می باشد.گستره:آمریکای شمال غربی. (ملک شادخت و فولاد1387)ویژگیهای فیزیکی:درختچه همیشه سبز تا 120 سانتی متر رشد می کند. این گیاه در تمام طول سال برگهای خود را حفظ می کند. گلدهی از فروردین تا خرداد ماه صورت می گیرد. گلها دوپایه می باشد. گیاه دگر گرده افشان می باشد. ارمک در خاک شنی و لومی با زهکش خوب رشد می کند. این گیاه خاکهای اسیدی، خنثی و قلیایی را ترجیح می دهد. در ضمن در سایه نمی تواند رشد بکند. (ملک شادخت و فولاد1387)کاربرد دارویی:ساقه ارمک تصفیه کننده خون، ادرارآور، تب بر و مقوی می باشد. همچنسن در درمان دردهای وابسته به دستگاه تناسلی کاربرد دارد. دم کرده ساقه در درمان مشکلات کلیوی، سوزاک و سفلیس در مراحل اولیه بکار برده می شود. از ساقه پودرشده ضمادی می سازند که بر روی زخمها می گذارند. ساقه دارای افدرین می باشد، آلکالوئیدی که در درمان آسم و بیماریهای تنفسی کاربرد دارد. ساقه های جوان را بهتر است خام بخورید. ساقه ها را در هر زمانی از سال می توان برداشت. (ملک شادخت و فولاد1387)جزئیات کاشت:ارمک خاک لومی با زهکش خوب و محیط آفتابی را می پسندد. این گیاه در برابر خشکی و خاکهای آهکی مقاوم می باشد. (ملک شادخت و فولاد1387)تکثیر:بذر را تا موقعی که برسد در پاییز درون گلخانه نگهداری کنید. در بهار هم می توان در گلخانه و در یک کمپوست شنی بذرپاشی کرد. جوانه ها را تا موقعیکه به قدر کافی بزرگ شوند در گلدانهای مجزا کاشته و از آنها در گلخانه مراقبت کنید تا زمستان به پایان برسد. گیاه را در بهار یا اوایل تابستان بعد از سرمای بهاره و با اندکی محافظت به زمین اصلی انتقال دهید. تقسیم گیاه در بهار یا پاییز صورت می گیرد. خوابانیدن هم در گیاه صورت می گیرد. (ملک شادخت و فولاد1387)

شنبه 21/5/1391 - 17:36

[ نظر به این مطلب ] - [ نظرات این مطلب : 0 ]

دنیای گیاهان و حیوانات

درختان و درختچه ها دارویی

پیرو: Latine name: Juniperus communis

Scientific name: Juniper

(استفاده زیاد از میوه پیرو باعث صدمه دیدن کلیه ها می شود. زنان باردار نباید از آن استفاده کنند.)ازخانواده Cupressaceae ، جنس Juniperus می باشد.گستره:شمال آفریقا، آسیا. (ملک شادخت و فولاد1387)ویژگیهای فیزیکی:درختچه همیشه سبز تا 9 متر رشد می کند. این گیاه نسبت به سرما حساس می باشد. برگها را در تمام طول سال حفظ می کند. گلدهی پیرو در ماههای اردیبهشت و خرداد و رسیدگی بذر در مهرماه صورت می گیرد. گلها دو پایه و گرده افشانی بوسیله باد صورت می گیرد. گیاه دگر گرده افشان می باشد. پیرو در خاکهای شنی، لومی، رسی و خیلی رسی بازهکش خوب رشد می کند. این گیاه در خاکهای فقیر هم رشد می کند. پیرو خاکهای اسیدی، خیلی اسیدی، خنثی، قلیایی و خیلی قلیایی را تحمل می کند. این گیاه در محیط بدون سایه و تا حدی سایه رشد می کند. آن در برابر خشکی و بادهای بحری مقاوم می باشد. (ملک شادخت و فولاد1387)کاربرد دارویی:میوه ها محتوی رزین، نوعی اسانس، روغنی که مواد اصلی آن پینن و برنئول است، اینوزیت، نوعی گلیکوزید فلاون و نوعی عنصر تلخ به نام ژونی پرین هستند آن ها شدیدا مدر هستند. (ولاگ و استودولا 1382 )میوه پیرو در درمان مشکلات گوارشی بعلاوه مشکلات مثانه و کلیه بکار می رود. میوه رسیده ضدعفونی کننده قوی، آروماتیک، بادشکن، معرق، ادرارآور، دوای محمر، اشتهاآور و مقوی می باشد. (ملک شادخت و فولاد1387)جزئیات کاشت:گیاهی است که در هر خاکی رشد می کند. PH حدود چهار تا هشت را تحمل می کند. محیط سایه دار را دوست ندارد. گیاه جوان در برابر سرمای بهاره مقاومت چندانی ندارد. (ملک شادخت و فولاد1387)تکثیر:بذر نیاز به استرافیکاسیون سرمایی دارد. چون بذر پوشش سختی دارد خیلی آهسته جوانه می زند. این بذر را به مدت 3 تا 6 ثانیه در آب جوش قرار دهید که باعث افزایش سرعت جوانه زنی می شود. بذر را تا موقعیکه برسد درون شاسی سرد نگهداری کنید. جوانه ها را در گلدانهای مجزا بکارید و از آنها مراقبت بکنید، سپس آنها را در اوایل تابستان به زمین اصلی انتقال دهید. در ماههای شهریور و مهر قلمه های پاشنه دار از چوبهای رسیده بریده و در شاسی نگهداری کنید. گیاه را در پاییز به زمین اصلی انتقال دهید. خوابانیدن در شهریور و مهرماه صورت می گیرد. (ملک شادخت و فولاد1387)

شنبه 21/5/1391 - 17:34

[ نظر به این مطلب ] - [ نظرات این مطلب : 0 ]

دنیای گیاهان و حیوانات

درختان و درختچه ها دارویی

زغال اخته:Latine name: Cornus officinalis

Scientific name: Shan Zhu Yu

از خانواده Cornaceae، جنس Cornus می باشد.گستره:شرق آسیا. (ملک شادخت و فولاد1387)ویژگیهای فیزیکی:درختچه برگ ریز زغال اخته تا 10 متر رشد می کند. این گیاه به سرما حساس نمی باشد. گلدهی در ماههای بهمن و اسفند و رسیدگی بذر در شهریور ماه می باشد. گلها دوجنسی و گرده افشانی بوسیله حشرات صورت می گیرد.زغال اخته در خاکهای شنی، لومی، رسی و حتی خیلی رسی رشد می کند. این گیاه در خاکهای اسیدی، خنثی، قلیایی و یلی قلیایی هم رشد می کند. این گیاه در محیط بدون سایه و تا حدی سایه رشد می کند. (ملک شادخت و فولاد1387)کاربرد دارویی:زغال اخته 2000 سال قبل در پزشکی چینی ها کاربرد داشته است. این گیاه برای کاهش خونریزیهای شدید قاعدگی بکار می رود و ترشحات بدنی مثل ادرار، انزال و احتلام زودرس و تعرق را فعال می کند. میوه ضدباکتری، ضدقارچ، کم کننده فشارخون، ضدتومور، ادرارآور، سودمند برای جگر و مقوی می باشد. میوه بدون بذر را جوشانده و برای درمان ورم مفاصل، تب و دیگر دردهای مزمن بکار می برند. میوه وقتی کاملاً رسیده است برداشت می شود داروی قابض، ضدمالاریا و مقوی می باشد. گیاه کلاً ضدباکتری، ادرارآور، کم کننده فشارخون و ضدعفونی کننده قسمتهای پیشابی می باشد. (ملک شادخت و فولاد1387)جزئیات کاشت:زغال اخته در خاکهای نسبتاً حاصلخیز و در محیط کاملاً افتابی و تا حدی سایه به خوبی رشد می کند. این گیاه تزئینی می باشد. (ملک شادخت و فولاد1387)تکثیر:بذر زغال اخته را تا موقعیکه برسد هم می توان در شاسی سرد کاشت هم می توان در محیط بیرون بکارید. گوشتهای روی بذر باید کاملاً از بذر جدا شود چون بازدارنده رشد بذر می باشد. بذرهای انبار شده 3 تا 4 ماه استرافیکاسیون نیاز دارد. جوانه زنی بذرها بویژه بذرهای انبار شده به آرامی صورت می گیرد و حدود 18 ماه طول می کشد.جوانه ها را تا موقعیکه رشد کافی بکند در گلدانهای مجزا بکارید و اجازه دهید گیاه زمستان را در گلخانه بگذراند. در ماههای تیر و مرداد قلمه های نیمه بالغ از ساقه گرفته و در شاسی می کارید. در پاییز در درون فصل رشد قلمه چوبهای رسیده جوانه دار را بریده و درون شاسی سرد نگهداری می کنید. خوابانیدن گیاهان جدید در ماه خرداد و تیر صورت می گیرد(حدود 9 ماه طول می کشد). (ملک شادخت و فولاد1387)

شنبه 21/5/1391 - 17:33

[ نظر به این مطلب ] - [ نظرات این مطلب : 0 ]

دنیای گیاهان و حیوانات

درختان و درختچه ها دارویی

درخت افسون:Scientific name: Illicium verumLatine name: Ba Jiao Hui Xian(میوه آن، مقداری سمی می باشد.)از خانواده illiciaceae، جنس illicium می باشد.گستره:شرق آسیا. (ملک شادخت و فولاد1387)محل رویش آن در چین، ژاپن، فیلیپین، جاوه وهند است. (زرگری 1360)ویژگیهای فیزیکی:یک درخت همیشه سبز تا 5 متر رشد می کند. گیاه حساس به سرما می باشد. افسون برگهای خود را در تمام فصول سال حفظ می کند. گلدهی از ماه اسفند تا اردیبهشت و رسیدگی بذر در ماه مهر صورت می گیرد. گلها دوجنسی می باشند. افسون خاک شنی و لومی با زهکش خوب را ترجیح می دهد. این گیاه در خاکهای اسیدی و خنثی رشد می کند. آن در محیط بدون سایه و تا حدی سایه رشد می کند. (ملک شادخت و فولاد1387)کاربرد دارویی:میوه افسون ضدباکتری، ضدنفخ، ادرارآور، بازدارنده دندان درد، محرک و اشتهاآور می باشد. همچنین در درمان دردهای شکمی، مشکلات سوء هاضمه، کمردرد و قولنج هم کاربرد دارد. میوه اثرات ضدباکتری مثل پنی سیلین دارد. میوه های نارس را می جوند و از میوه های رسیده به خاطر روغنهای آن استفاده می کنند. (ملک شادخت و فولاد1387)ترکیبات شیمیایی شامل اسانس آن است که به مقدار چهار تا پنج درصد در میوه وجود دارد. علاوه بر اسانس، شامل موسیلاژ، قند و غیره است. دانه آن دارای روغن و آلورون است. (زرگری 1360)جزئیات کاشت:افسون در خاک سبک، مرطوب لومی با زهکش خوب و محیط محافظت شده و آفتابی رشد می کند. این گیاه درجه حرارت بین 5 تا 10 درجه زیر صفر را تحمل می کند. (ملک شادخت و فولاد1387)تکثیر:بذر را در اوایل بهار در گلخانه بکارند. جوانه ها را در گلدانهای مجزا کاشته و تا وقتیکه به قدر کافی بزرگ شوند از آنها مراقبت کنید. گیاه را در اواخر بهار یا اوایل تابستان بعد از سرمای بهاره در زمین اصلی بکارید (باید توجه کرد که در برابر سرما از آن محافظت کرد). خوابانیدن در بهار صورت می گیرد. قلمه چوب های نیم بالغ را در مردادماه درون شاسی بکارید. این قلمه ها وقتی ریشه دادند در اولین زمستان در گلخانه نگهداری می شوند و بعد از سرمای بهاره به زمین اصلی انتقال داده می شوند. (ملک شادخت و فولاد1387)

شنبه 21/5/1391 - 17:31

[ نظر به این مطلب ] - [ نظرات این مطلب : 0 ]